摘要：為探究浙江省舟山市某養(yǎng)殖池塘中三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴發(fā)疾病的病因,應用組織病理學、分子生物學和熒光原位雜交等技術手段,對患病三疣梭子蟹組織進行檢驗。研究發(fā)現(xiàn),患病三疣梭子蟹的臨床癥狀主要表現(xiàn)為食欲下降,行動遲緩,鰓水腫;光學顯微鏡下觀察鰓及血淋巴液未發(fā)現(xiàn)寄生蟲,肝胰腺等組織中也未分離到致病菌;采用PCR方法對病蟹進行血卵渦鞭蟲(hematodinium)、白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、青蟹雙順反子病毒(mud crab discistrovirus-1,MCDV-1)以及青蟹呼腸孤病毒(Scylla serrata reovirus,SSRV)蟹類常見病原PCR檢測,結果均為陰性;病蟹的肝胰腺、心臟、鰓等組織的病理切片中可觀察到明顯的細胞病變和嗜酸性包涵體;超薄切片電鏡觀察顯示:病蟹的肝胰腺、心臟和鰓組織中均存在六邊形病毒顆粒,粒子直徑150nm左右,與已報道的十足目虹彩病毒1 (decapoda iridescent virus 1,DIV1)形態(tài)特征相似。采用特異性套式PCR檢測方法對患病蟹組織樣品進行DIV1病原檢測,所有樣本均擴增出457 bp和129 bp大小的目的片段。進一步根據(jù)Gen Bank中DIV1的主要衣殼蛋白(major capsid protein,MCP)表達基因和三磷酸腺苷酶(ATPase)表達基因序列設計特異性引物,均能從病蟹樣品中擴增出預期大小的MCP和ATPase基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)區(qū)全長。將擴增獲得的MCP和ATPase基因ORF區(qū)全長進行測序和同源序列比對分析,進化樹分析結果表明其與十足目虹彩病毒屬(Decapodiridovirus)病毒的MCP和ATPase基因序列自然聚為一支,判定導致此次三疣梭子蟹發(fā)病病原為DIV1。根據(jù)原位雜交探針設計原則,以DIV1的MCP和ATPase基因的保守區(qū)域為靶位點分別設計探針,通過熒光原位雜交獲得了病毒粒子在病蟹肝胰腺、心臟、肌肉和鰓組織的分布情況,與電鏡切片觀察和套式PCR檢測結果相符。研究結果可為海水養(yǎng)殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1病診斷與防控提供參考。
